דו"ח ניסוי – הפרדת חלבונים: כימות ריכוז חלבון בתמיסה והפרדת חלבונים לפי משקל מולקולארי לצורך קבלת מידע על ביטוי החלבונים ERK ו-p-ERK לאחר סטימולציה באינסולין בתרבית תאים

קורס ביוכימיה א'

דו"ח ניסוי – הפרדת חלבונים:

כימות ריכוז חלבון בתמיסה והפרדת חלבונים לפי משקל מולקולארי על מנת לקבל מידע על ביטוי החלבון ERK ו p-ERK לאחר סטימולציה באינסולין בתרבית תאים

תוכן העניינים

מטרת הניסוי – 3
מהלך הניסוי – 3
מבוא – 4
שיטות – 5
חלק 1 – קביעת חלבון לפי עקומת סטנדרט :- 5
חלק 2 – לאחר מכן אנו נמיס את הליזט בתוך sample buffer שמכיל:- 5
חלק 3 – הגבה עם נוגדנים:- 5
תוצאות :- 7
הכנת דוגמאות :– 7
תוצאות אלקטרופורזה 10
דיון ומסקנות:- 13

מטרת הניסוי

לכמת ריכוז חלבון בתמיסה ולהפריד חלבונים לפי משקל מולקולארי על מנת לקבל מידע על ביטוי החלבון ERK ו p-ERKלאחר סטימולציה ב אינסולין בתרבית תאים.

מהלך הניסוי

שלב 1 – קביעת חלבון בשיטת ברדפורד . הכנה של עקומת סטנדרט עם BSA ולפי משוואת הישר שתתקבל יחושב ריכוז החלבון בתמיסות הליזט.

שלב 2 – אלקטרופורזה . העמסת החלבונים לאחר טיפול ב SDS ו DTT על ג'ל פוליאקרדאמיד כאשר ההפרדה היא לפי משקל מולקולרי של החלבונים . הרצה עם סמן (MARKER) ולאחר מכן העברה לממברנה ניטרוצילולוזית.

שלב 3 – אנקובציה עם נוגדנים כנגד ERK ו p-ERK וצילום הממברנה לאחר מכן עם מכשיר XRS .

מבוא

חלבונים הם מקרומוליקולות החשובות לקיום התא שכן הן אחראיות לביצוע מגוון רחב של פעולות ותפקידים בתא שנעים בין קטליזת ריאקציות לבין תפקידים מבניים בתא , חשוב מאוד לחקור את מבנה החלבונים , הרכבם ותכונות פיזיקליות אחרות שכן כל אלו משפיעים על הבנת פעילותם ותכונותיהם , הפרדת חלבונים חשובה מכיוון שבתא ישנם אלפי סוגים של חלבונים שונים בעלי תפקידים שונים ותכונות פיזקליות וביוכימיות שונות , על מנת לאפיין פעילות חלבונית בתא שהינה ספציפית לחלבון אחד יש להפרידו בעזרת שיטות ביוכימיות שונות על מנת לאפיין את החלבון , בניסוי זה נפריד חלבונים באלקטרופריזה בג'ל פוליאקרמיד שהינה שיטה להפרדה לפי גודל ולאחר מכן אנו נעביר את החלבון לממברנת צילולוז והוא יודגר עם נוגדנים בעלי ספיציפיות לחלבון הנלמד , וכמובן קומפלקס זה יודגר עם חלבון שניוני שקשור לאלמנט מדווח , במקרה הזה אנזים פרוקסידאז , שמקטלז ריאקציה שמשחררת פוטונים , ולפי קריאת סרט הצילום אנו נזהה את החלבון הנלמד.